In situ hübridisatsioon

in situ hübridisatsioon on meetod kromosoomaberratsioonide tuvastamiseks. Teatud kromosoomid on tähistatud fluorestsentsvärvainetega ja seotud DNA sondiga. Seda tehnikat kasutatakse geenimutatsioonide sünnieelseks diagnoosimiseks.

Mis on in situ hübridisatsioon?

In situ hübridisatsiooni või Fluorestsentsi in situ hübridisatsioon RNA või DNA nukleiinhapped tuvastatakse teatud kudedes või rakus molekulaargeneetiliste meetodite abil. Tavaliselt kasutatakse seda tüüpi diagnoosi raseduse ajal esineva strukturaalse või numbrilise kromosomaalse kõrvalekalde tuvastamiseks.

Sel eesmärgil kasutatakse kunstlikult valmistatud sondit, mis ise koosneb nukleiinhappest. Seejärel seostub see aluse sidumise kaudu organismis olevate nukleiinhapetega. Seda sidet mõeldakse terminiga hübridisatsioon. Tõendid põhinevad patsiendi elustruktuuril ja vastavad seetõttu in situ tõenditele. Seda tuleb eristada in vitro meetoditest, mille puhul tuvastamine toimub katseklaasis. Meetodi töötasid välja 20. sajandil teadlased Joe Gall ja Mary Lou Pardue.

Pärast seda on tehnoloogia arenenud. Kui sel ajal kasutati radioaktiivseid sonde, siis tänapäeval kasutatakse näiteks markermolekulidega kovalentse sidemega fluorestsents-märgistatud sondid.

Funktsioon, mõju ja eesmärgid

In situ hübridisatsiooni kasutatakse tavaliselt kromosoomaberratsioonide, s.o kromosomaalsete anomaaliate, mida karüogrammis ei ole võimalik tuvastada, tuvastamiseks. See tähendab, et seda meetodit kasutatakse alati pärilike haiguste määramiseks raseduse ajal.

Kuna kromosoomaberratsioonid on probleem, mida ei tohiks tänapäeval alahinnata, on meetodi kasutamine aja jooksul suurenenud. Hübridiseerimine toimub ema amniootilisest vedelikust pärinevate looduslike rakkude alusel. Tehnoloogia alus on värvimärgistatud sondi sidumine DNA osadega. Tänu sidumisele saab koopiate arvu hiljem mikroskoobi abil hinnata, kuna üksikud koopiad eraldavad valgussignaali ja on seega mikroskoobi all nähtavaks tehtud. Protseduure on erinevaid. Analüüs toimub kohe pärast sidumist.

Sel juhul kasutatakse fluorestsentsvärvi nagu biotiin, mis seotakse otse DNA sondiga. In situ hübridiseerimise kaudse meetodi korral ei saa hindamist toimuda kohe pärast hübridiseerimist, kuna fluorestseeruvad ained võivad sondiga seonduda alles pärast hübridiseerumist. Seda kaudset meetodit kasutatakse sagedamini kui otsest, kuna arvatakse, et see on tundlikum. Lisaks kromosoomspetsiifilistele tsentromeetri DNA-sondidele on olemas ka lookusespetsiifilised DNA-sondid, kromosoomspetsiifilised DNA raamatukogu sondid ja võrreldavad genoomi hübridisatsioonid.

Kromosoomi-arvuliste anomaaliate tuvastamiseks saab kasutada kromosoomispetsiifilisi tsentromeetri DNA-sondid. See tähendab, et neid kasutatakse peamiselt siis, kui kahtlustatakse dubleeritud või kustutatud kromosoome. Asukohaspetsiifilised DNA-sondid on eriti sobivad minimaalsete mutatsioonide tuvastamiseks, mida karüogrammis pole võimalik tuvastada. Kromosoomispetsiifilist DNA raamatukogu sondi kasutatakse eriti sisestuste ja translokatsioonide tuvastamiseks.

Genoomi võrdlev hübridisatsioon on teiselt poolt kromosomaalse materjali kadude ja juurdekasvu terviklik analüüs. Tänapäeval on in situ hübridisatsioon väga oluline erinevate kromosoommutatsioonide diagnoosimisel.Downi sündroomi diagnoosimisel seostuvad sondid näiteks kromosoomiga 21. Sel eesmärgil kasutatakse tavaliselt kromosoomspetsiifilisi sondid, mida saab kasutada selle haiguse kahtluse korral.

Kahtlus võib tekkida näiteks juhul, kui vanemad on varem haigusega lapse sünnitanud ja ultraheli pilt on ebanormaalne. Kui kaksiksideme asemel on kolmik ja seega väljastatakse kolmekordne värvisignaal, loetakse diagnoos kinnitatuks.

Riskid, kõrvaltoimed ja ohud

Vastupidiselt näiteks PCR-le on in situ hübridisatsioon saastumise suhtes oluliselt vähem vastuvõtlik. Lisaks on protsessiks vajaminev aeg tohutult vähem. Kuna embrüod moodustavad eelkõige kromosoomimustrid, ei saa seda mustrit kasutada järeldamaks ülejäänud kromosoomijaotust ja seega ka teiste rakkude geneetilist seisundit.

Värvisignaalid võivad ka kattuda või jääda muudel põhjustel nähtamatuks. Selle tulemusel on in situ hübridiseerimisel diagnostilise vahendina raseduse ajal suhteliselt palju vigu. Võib tekkida väärdiagnoose ja vanemad võivad tervisliku embrüo kasuks otsustada. In situ hübridisatsiooni vigade suhtes tundlikkuse vähendamiseks tuleks samaaegselt uurida vähemalt kahte embrüonaalset rakku. Kahe raku paralleelsel uurimisel on nüüd väärdiagnoosimise oht vaid tühine.

Sellisel juhul saavad vanemad diagnoosile absoluutselt tugineda. In situ hübridisatsiooni ei pakuta igale rasedale, vaid ainult riskirühma kuuluvatele naistele. Sellest hoolimata ei keelata rasedatel seda tüüpi diagnoosi omal soovil. Ebanormaalsed ultraheliuuringud või ebanormaalne seerum võivad kutsuda arsti üles pakkuma diagnostilist protseduuri. In situ hübridisatsiooni abil saab diagnoosida suure osa kromosoomaberratsioonidest, kuid mitte kaugeltki mitte kõiki.

Seetõttu ei tohi in situ hübridisatsiooni kunagi läbi viia üksi, vaid seda tuleb alati kasutada koos tavapärase kromosoomi testiga. Selles protseduuris mängib suurt rolli rase naise hooldus. Enne analüüsi on diagnostilise meetodi osas põhjalik arutelu lapseootel emaga, kus selgitatakse tehnoloogia riske, võimalusi ja piire.